Stoffwechselbelastung und Ressourcenzuteilung in Pseudomonas putida während der Expression eines Syntheseweges für die Geransäureproduktion

Für die Produktion von industriell relevanten Chemikalien werden noch immer in erster Linie fossile Rohstoffe verwendet. Eine nachhaltige Alternative bietet die biotechnologische Produktion dieser Chemikalien durch Bakterien. Allerdings führt die Implementierung eines heterologen Stoffwechselweges in einen bakteriellen Wirt zu einem erhöhten Bedarf an Energie und zellulären Ressourcen wie Aminosäuren, Ribosomen und Polymerasen. Das Ergebnis ist eine Umverteilung der normalen zellulären Funktionen auf die zusätzlich implementierte Aufgabe. Die Einschränkung bereits einer dieser Ressourcen führt in der Regel zu einer Verringerung der Wachstumsrate und zu der Einstellung der heterologen Produktion, ein Zustand, der als metabolische Belastung definiert wird.
Um die metabolische Belastung möglichst gering zu halten ist ein umfassendes Verständnis der Physiologie und des Stoffwechsels der heterologen Proteinüberproduktion des Wirts unabdinglich. Für Pseudomonas putida, ein vielversprechender Modellorganismus für moderne biotechnologische Anwendungen, mangelt es an diesem Verständnis.
Daher ist die Zielsetzung dieses Projektes die Untersuchung der metabolischen Belastung von P. putida währen der heterologen Produktion von Geransäure. Geransäure ist ein Monoterpenoid, das ein großes Potenzial für verschiedene industriell relevante Anwendungen aufweist, z. B. als Duftstoff oder Antimykotikum.

Der erste Schritt ist es einen synthetischen Geransäure Stoffwechselweg in P. putida einzubringen. Hierfür werden Gene aus Myxococcus xanthus und Ocimum basilicum implementiert. Um die zelluläre Kapazität während der Expression heterologer Proteine verfolgen zu können, wird P. putida CAP verwendet, welcher das Gen für das fluoreszierende mCherry-Protein unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors im Chromosom trägt. Das mCherry-Signal dient als Indikator für die zelluläre Kapazität, da es den Anteil der zellulären Ressourcen widerspiegelt, der für die nicht-regulierte Genexpression verwendet wird. Der Kapazitätsmonitor trägt zusammen mit der Wachstumsrate zur Charakterisierung der metabolischen Belastung bei. Darüber hinaus sollen metabolomische, transkriptomische und proteomische Bestimmungen durchgeführt werden, um ein vollständiges quantitatives physiologisches Bild der manipulierten Stämme zu erhalten.

Die gesammelten Daten sollen dann in eine kohärente mathematische Beschreibung integriert werden. Um die zellulären Prozesse und Einschränkungen während der heterologen Proteinproduktion zu verstehen, ist es notwendig, die Verteilung der Ressourcen auf die intrinsischen Prozesse, die für die Zellerhaltung erforderlich sind, und die zusätzliche Belastung durch den heterologen Weg quantitativ zu beschreiben. Eine quantitative Beschreibung basiert in der Regel auf einem mathematischen Modell, das im Rahmen dieses Projekts entwickelt werden soll. Das Modell kann schrittweise durch weitere Experimente verfeinert werden und durchläuft so den typischen Lebenszyklus der Modellentwicklung (Modellverbesserung - Modellvalidierung - Modellanwendung).

Projektbetreuung: M.Sc. Carina Meiners

Startdatum des Projektes: 01.11.2022